期刊：Bioresource Technology
影响因子：6.669
派森诺近期与黑龙江八一农垦大学合作，在《Bioresource Technology》（影响因子:6.669）发表文章，对生物预处理玉米秸秆可提高厌氧消化系统中甲烷产量的现象进行了研究探讨。通过对未处理和预处理的秸秆样品进行DNA水平的16S rRNA基因测序与RNA水平的16S rRNA测序以及宏转录组测序分析，获得样品中的菌群结构及活性菌群变化情况，同时根据宏转录组测序的结果定向检测产甲烷峰值期样品中功能、代谢途径的变化特征。
研究背景?
玉米秸秆是中国主要的农业废弃物，生物质循环是减少填埋或焚烧有机物质造成环境压力的主要解决方案。玉米秸秆可作为厌氧消化（AD）生产甲烷的主要原料，而甲烷是生物质能量的重要组成部分。木质纤维素是一种复杂的大分子，是秸秆细胞壁的主要成分，而植物细胞壁对微生物和酶解构具有耐受性。由于其结构和化学性质，木质纤维素的水解是AD的限速步骤之一。所以对秸秆进行预处理是增加厌氧消化中甲烷产量的有效方法。
微生物生物预处理被认为是促进生物降解和增加秸秆沼气生产的有效方法，具有低能耗和安全等优点。其中微生物复合菌系可以通过显著增加厌氧消化早期的甲烷产量来提高AD活性的产甲烷效率。以前的研究将注意力集中在预处理阶段，并系统地分析了木质纤维素在该过程中的分解机理。这包括对上游阶段微生物群落多样性和组成功能的分析。但预处理对AD系统中微生物的重要性还没有得到足够的重视。特别是，增加甲烷产量与AD系统中微生物群落结构、活性和功能表达的变化之间的关系需要进一步探索。
本研究中，作者同时进行了以DNA水平的16S rRNA基因测序和RNA水平的16S rRNA测序以及宏转录组分析，分别从菌群结构及活性菌群两种水平探讨了微生物群落在厌氧消化过程中的结构、活性、功能、代谢途径的变化。本文的研究针对微生物复合菌系对预处理条件的逆向优化以及如何发挥更大的潜力具有重要意义，同时也为预处理中微生物的筛选提供了依据。
研究方法?
测序技术：Illumina MiSeq与Illumina HiSeq X-ten高通量测序平台
测序模式：微生物组16S rRNA基因与16S rRNA V4区测序、宏转录组测序
实验设计：收集产甲烷峰值期（进料后24小时）和稳定期（进料后48小时）的污泥样品。通过在4℃以13,400 g离心15分钟使样品沉淀，并立即用于DNA和RNA提取，进行16S rRNA V4区多样性组成谱测序；另对产甲烷峰值的样品进行宏转录组测序。
研究结果
微生物结构群落及整体活性变化
微生物群落组成和活性微生物群落聚集在PCA主成分分析图的两个不同的区域。对于DNA水平的微生物群落，未处理的秸秆和预处理的秸秆的两个时期中的所有样品聚集在右侧。在沼气生产的峰值和稳定阶段的样本的聚类结果中，未处理的秸秆和预处理的秸秆的群落结构仅存在微小差异。两个时期的样品中，RNA水平的活性微生物群落都聚集在左侧，并与DNA水平的微生物群落结构的聚类结果分开。在沼气生产的高峰期和稳定期，生物预处理中的活性微生物群落与未处理的秸秆中活性微生物群落显著不同。
主要微生物与微生物功能研究
RNA水平的多样性组成谱分析显示，生物预处理组中最活跃的微生物是Methanosaeta，在高峰期具有10.8％的丰度。虽然在稳定期其丰度降至6.9％，但仍显著高于未处理秸秆组的丰度（P<0.01）。丰度排名第二的微生物是Longilinea，在高峰期活动为6.8％，稳定期活性降至4.3％。Methanoculleus（一种仅次于Methanosaeta丰度的古细菌）的丰度分别在高峰期和稳定期分别为2.5％和2.0％。在未处理秸秆组的高峰期和稳定期期间，最活跃的微生物是Ruminofilibacter。Methanosarcina 的丰度显著低于Ruminofilibacter，其丰度在峰值和稳定期分别达到5.2％和3.3％，成为两个时期最活跃的古菌。Methanoculleus 的丰度也值得关注，在高峰期丰度为4.2％。在未经处理的秸秆中，主要基质是玉米秸秆，具有木质纤维素降解能力的一些细菌成为优势微生物的事实是有意义的。许多研究还报道了这些微生物在AD系统中占主导地位，同时该研究还发现产甲烷古菌是甲烷产量高峰时菌群结构中最活跃的微生物。
使用Metastats分析了属水平上物种的显着差异。对于微生物群落的组成，微生物数量存在显着差异，在沼气生产高峰期未处理的秸秆和预处理的秸秆中有48个属，在稳定期有51个属。对于活性微生物群落，在高峰期未处理的秸秆和预处理的秸秆之间有63种不同的属，在稳定期有58种。
微生物群落功能的变化
不同的产甲烷古菌在产甲烷途径中起不同的作用。产甲烷效率的提高是菌群结构的直接表现。分析菌群结构的功能变化更有利于解释生物预处理的影响。在KEGG代谢通路分析中，发现两者表达水平显著不同，排在前十位的代谢途径也是如此。在生物预处理秸秆组和未处理秸秆组中，甲烷代谢（ko00680）与碳代谢（ko01200）基因表达差异最大。甲烷代谢是AD系统中最重要的功能，碳代谢与甲烷代谢密切相关。
生物预处理和未经处理的秸秆在甲烷代谢方面存在显著差异，同时甲烷代谢也与甲烷的产生直接相关。因此，探索甲烷代谢的内在途径变化具有重要意义。在KEGG基因表达水平上来看，共有17个KOs表达水平有显著差异，14个与产甲烷直接相关的KOs在生物预处理中显著上调。涉及Mcr、Mtr、Acss、Fwd、Frh以及Mvh等四种关键酶和两种辅酶基因的表达。
总结
厌氧系统中的微生物群落结构受底物变化影响较小，其稳定性确保了甲烷的连续生产。然而，活性菌群表现出了一定的灵活性，在使用预处理的秸秆消化过程中，丰度高的产甲烷古菌发生了变化。在产甲烷古菌中，Methanosaeta 通过对乙酸的特殊捕获能力，对提高产甲烷效率做出了重要的贡献。总体而言，经历生物预处理的材料消化过程中的甲烷生成量有显著提高。
参考文献
Zhao Y, Xu C, Ai S, et al. Biological pretreatment enhances the activity of functional microorganisms and the ability of methanogenesis during anaerobic digestion[J]. Bioresource Technology, 2019: 121660.
