发表期刊《Food Chemistry》
影响因子：6.306
派森诺在宏转录组学研究领域已积累了丰富经验。继去年与黑龙江八一农垦大学合作，在《Bioresource Technology》（影响因子：7.539）发表研究成果后【派森诺项目文章】宏转录组研究强势登录BT！（点击查看），我们近期与沈阳农业大学合作，并在《Food Chemistry》（影响因子：6.306）发表研究论文。 在这项研究中，作者成功地从大酱样本中提取了微生物组总RNA，并运用宏转录组测序技术，解析了不同发酵阶段活性菌群的结构和功能，同时还检测了整个发酵过程中生化指标和风味成分的变化。最后，通过微生物组——生化指标——风味成分的联合分析，确定了大酱发酵过程中香味产生的作用机理和关键微生物成员。 研究背景 大酱是东北传统制作的自然发酵豆酱，因其风味与高营养价值而成为调味佳品。目前的研究显示，大酱的风味与微生物群落的作用有密切关联。目前的研究大多基于发酵过程中微生物产生的代谢物和风味诱导化合物进行解析，但驱动发酵过程的微生物群及其与主要风味代谢物的相关性仍有待阐明。之前的研究也主要在DNA层面上对发酵豆酱微生物群落的物种组成、丰度和代谢潜力进行了研究，而无法确定这些微生物是否确实在发酵过程中起作用，也没有确定在发酵或赋予风味中起关键作用的重要微生物群。 宏转录组测序，可以针对大酱中的活性微生物群落进行研究，将细菌、真菌等各种类的活性菌群一网打尽，并找出活跃表达的基因，从而揭示相关微生物的群落结构与功能的变化，非常有利于确定在发酵或赋予风味中起关键作用的微生物物种。因此，本研究利用宏转录组测序对大酱中的微生物群落结构与功能进行了深入研究。 研究目的 研究发酵过程中活性微生物群落、生化指标和风味物质的变化及相互关系，进而确定在发酵或赋予风味中起关键作用的核心微生物。 材料与方法 测序技术：Illumina HiSeq高通量测序平台 测序模式：宏转录组测序 研究结果 ① 首先，对不同发酵阶段的大酱样本进行宏转录组测序，解析大酱中的活性菌群组成和功能特征。 ●大酱中的活性菌群结构 如图1所示，豆酱中的优势微生物主要属于厚壁菌门（95.2%），主要属为四联球菌（60.7%）、乳杆菌（19%）、葡萄球菌（6.4%）、海洋杆菌（2%）和肠球菌（1.4%）。 有趣的是，一些真菌属和病原菌，比如酵母属、曲霉属、毛霉属，以及葡萄球菌，在发酵初期也很丰富，但随着发酵的进行而减少，这些菌很可能是在早期被引入或者只在初期发挥作用，但对液态酱的发酵过程没有显著影响。 图1 不同发酵时间下，门水平（a）和属水平（b）的活性微生物群落结构变化 ● 大酱中正在表达的功能信息 宏转录组Unigenes的KEGG代谢数据库注释结果显示，代谢相关的基因丰度是高的，在初始阶段即高达41.7%，在后续发酵过程中快速增加至54.1%，并在58%左右保持稳定。同时，代谢相关的基因主要集中在碳水化合物代谢上，呈现出先快速增加，再略微下降，而后又增加的趋势。有趣的是，这一趋势与四联球菌的相对丰度一致！ 结合CAZy数据库的注释结果，研究发现，以糖苷或寡糖键为目标的糖苷水解酶在发酵中期（H14-H28）高度活跃。碳水化合物和氨基酸代谢也在此期间也达到高峰，与微生物群落结构的快速变化相一致，这可能和风味的形成有很大关联。 图2 KEGG一等级与二等级注释结果 ② 随后，采用顶空固相微萃取（HS-SPME）、结合气相色谱-质谱（GC-MS）和自动氨基酸分析，检测整个发酵过程中生化指标（亚硝酸盐、盐度、pH、色泽）和风味成分（挥发性风味物质、游离氨基酸）的变化。 ● 大酱发酵过程中的代谢物变化 如表1所示，在豆酱中检测到10种主要的风味相关成分，包括2种醇、3种酯、2种酸和酚以及3种醛和酮。在早期发酵阶段（H0）仅检测到少量化合物，表明大多数挥发性物质可能是在液态酱的发酵过程中产生的。 同时，发酵酱中共检测到17种游离氨基酸，根据味道特征，将其分为鲜味、甜味、苦味和无味。这些氨基酸随着发酵的进行而稳定增加，并在发酵结束阶段达到最高。 表1 不同发酵时期主要挥发性成分的组成和含量 表2 不同发酵时期氨基酸的组成和含量 ③紧接着，通过关联分析确定产生香味物质的标志微生物（Biomarker）。 ● 微生物群落与理化性质和代谢产物的相关性 RDA冗余分析显示（图3），盐度、pH、色泽是发酵过程中菌群变化的重要影响因素。同时，发酵后半段（H28、H42和H56）的大酱微生物群落更接近，多数微生物彼此之间呈正相关性，与pH值也呈正相关，只有四联球菌、海洋杆菌和库尔特氏菌与pH值呈负相关，它们可能对亚硝酸盐的产生有抑制作用。同时乳酸杆菌和四联球菌丰度的增加与色度呈正相关，乳酸杆菌丰度的增加与盐浓度呈正相关。这些结果显示，发酵豆酱中的常驻微生物具有鲜明的生理特征，能够适应不断变化的环境。 图3 RDA冗余分析 Spearman关联网络分析进一步表明，微生物和代谢物之间存在显著的相关性。如图4所示，有24个细菌属，8个真菌属，都与代谢物存在显著相关性。它们有的和游离氨基酸的产生显著相关，有的和一些挥发性成分显著相关，而挥发性酯、乙酸和苯甲醛这类挥发性成分对大酱的风味至关重要。关联网络分析直接表明，四联球菌和乳酸杆菌分别与苯甲醛和冰醋酸呈正相关。此外，乳杆菌和一些肠球菌科微生物与挥发性酯呈显著正相关，表明它们在豆酱发酵过程中直接或间接参与脂质代谢。赖氨酸芽孢杆菌、葡萄球菌和蜜蜂球菌也与鲜味氨基酸呈正相关，可能有助于大豆酱鲜味的提升。 图4 “微生物组—代谢物”的Spearman关联网络分析 最后，根据上述活性微生物、功能、理化性质、代谢物检测及关联分析的结果，深入分析，并得出结论：乳酸杆菌与四联球菌是影响色泽和风味的核心菌属，它们产生的酶催化一系列代谢途径，从而产生风味物质！ 总 结 本研究利用宏转录组测序、HS-SPME-GC-MS和氨基酸分析方法，解析了大酱菌群和发酵物代谢谱随时间的变化，并鉴定出10种有助于大豆酱风味形成的挥发性化合物。此外，还进一步分析大豆酱中活性微生物与理化特性和风味物质之间的相关性，结果表明，乳杆菌属和四联球菌属是影响色泽和风味的重要属。这些微生物产生的酶催化一系列代谢途径，从而产生风味物质。该研究的发现为菌群在发酵食品风味形成中的作用提供了新的见解。 本研究的测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。 文章索引： Feiyu An, Mo Li, Yue Zhao, et al. Metatranscriptome-based investigation of flavor-producing core microbiota in different fermentation stages of dajiang, a traditional fermented soybean paste of Northeast China[J]. Food Chemistry, 2020: 128509. 点击阅读原文： https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0308814620323712
