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科研服务

DNA合成

常见问题

  • 1. 如何测定引物的OD值?

    用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量,请注意紫外分光光度计的使用,测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度,即为所测体积的OD值,进而可以计算出母液的OD值。 举例:您拿到一管干粉的DNA,用1ml水溶解成母液,取该母液50μL稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的吸光度为0.25,说明该50μL中含有0.25OD的DNA,也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。
  • 2. 如何检测引物的纯度?

    实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,<12个碱基的引物用20%的胶,12-60个碱基的引物用16%的胶,>60个碱基的引物用12%的胶,取0.2OD左右的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95oC,2min)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的(有时由于变性不充分,主带之上可能会有条带,乃是引物二级结构条带)。
  • 3. 合成引物的稀释与保存?

    初始拿到的DNA,其性状为薄膜状或者粉末状的白色粉末,附在离心管内壁上。稀释前,请将引物管离心数秒使DNA聚集到管低,小心开启管盖,以免引起粉末飞扬造成DNA损失,再加入适量的TE缓冲液,盖好管盖,漩涡振荡混匀并使其充分溶解。建议将引物稀释于TE(10mM Tris-HCL,pH8.0,1mM EDTA)溶液中,浓度高于10μM,并于-200C储存。 例如:如果您需要稀释到10μM,只需要加入(管内总nmol数/10)ml的TE即可。没有溶解的引物非常稳定,可以在-20℃下保存至少1年,溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液,分装数份保存于-20℃冰箱,可以保存至少半年以上(反复多次冻融会降低使用寿命)。
  • 4. 荧光标记的DNA如何稀释与保存?

    荧光标记(如HEX,TET,FAM,Cy3,Cy5等)的DNA对光较敏感,在合成及运输过程中,此类引物应确保最大程度的避光。接到合成引物后,请立即避光保存。对于非Cy类的荧光标记引物,建议将引物稀释于TE溶液中,浓度高于10μM,并于-20℃储存于暗盒中。Cy3及Cy5标记的引物在碱性条件下易降解,所以此类引物应于中性条件下在-20℃避光保存。
  • 5. 一般的合成的引物在5"和3"末端有磷酸基团吗?

    没有,5"和3"末端均为-OH基。如需要加磷酸基团,订货时请特别注明,此时需收取磷酸化的费用。
  • 6. 如何将两条互补的单链退火形成双链?

    用退火缓冲液(10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA)溶解引物, 将要退火的引物等摩尔数混合,总体积不要超过500微升,加热到95℃ 2mins,然后缓慢冷却至室温(低于30度)即可。退火的产物可以放在4度待用。
  • 7. 引物在常温下运输,会降解吗?

    不会降解,干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上。而一般的运输时间通常都在1-3天,所以您收到的引物不会降解。
  • 8. 合成的引物进行PCR反应时无目的带,怎么办?

    PCR反应失败的原因很多,可以从以下几个方面考虑。 1) 引物和模板是否配对,同源性有多大? 2) 引物本身是否有立体结构? 3) PCR反应用试剂是否能正常工作? 4) PCR仪是否工作正常? 5) PCR反应条件是否合适? 如果一切正常,还无法解决问题时,我们可以免费重新合成引物。
  • 9. 已经溶解的引物,为什么原先使用正常,而过一段时间再使用就不好了?

    如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶,会使引物降解。使用时没有充分解冻混合,液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物,避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5),引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题,而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。
  • 10. 引物纯化方式有哪些,如何选择?

    ◆ C18柱脱盐:有人称其为简易反相柱,它对DNA有特异性的吸附,可以被有机溶解洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上,它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。 ◆ PAGE纯:PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于95%,对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。 ◆ HPLC纯化:HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高,批量生产效率不高。
  • 11. 如何计算引物的Tm值?

    引物设计软件都可以给出Tm,引物长度,碱基组成,引物使用缓冲的离子强度有关。 长度为25mer以下的引物,Tm计算公式为:Tm = 4℃(G C) 2℃(A T) 对于更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为: Tm = 81.5 16.6 x Log10[Na ] 0.41 (%GC) – 600/size 公式中,Size =引物长度。
  • 12. 引物(含修饰)的分子量是如何确定的?

    非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5,引物的分子量=碱基数 x碱基的平均分子量。或按下列公式计算MW= (NA * WA) (NC * WC) (NG * WG) (NT * WT) (Nmod * Wmod)+(Nx * Wx) ( Ni* Wi) 16* Ns– 62.NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量,WA, WC, WG, W, Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量,Nmod,Wmod, 分别为修饰基团的数目和分子量。 对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数,例如G A混合的分子量为(313.21 329.21)/2 = 321.21。Ns为硫代数目,硫代每个位置增加分子量16。 常规碱基分子量
  • 13.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题?

    连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上,引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上,需要检查载体的酶切效果,需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构,退火的难度较大,退火时需要提高退火温度。
  • 14.测序发现引物有突变是怎么回事?

    测序发现引物区域有突变,特别是40个碱基以下的引物,发生的概率不大,但是肯定也会发生。用户一般可以放心,引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列COPY到合成仪的,碱基输错的机会不多。我们有一套控制办法,预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释,人们还没有办法彻底解决这个问题。引物合成的固相合成原理都一样,采用的机器也基本相同,合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的,所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似,没有人可以超脱。 引物合成是一种多步骤的化学反应,合成效率最高也就是99%,副产品不可以避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复,一般认为,偶连过程中,正在偶连的部分单体发生丢失DMT,导致单体又接了上去,故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变,一般认为是一般认为是带帽(capping)反应不彻底造成的,Caping反应主要是封闭极少数5"-羟基没有参加反应单体。被封闭的引物,在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变,产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护,即引物上可能含有残留保护基团,引物的这些区域不能很好地与互补链配对,当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中,可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在G转换成其它碱基。碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体 (脱嘌呤),2,6 diaminopurine , DNA复制和扩增过程中DNA聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基A,测序就会发现碱基G-A置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。脱嘌呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解,测序就会发现碱基G或A的缺失。 引物合成过程中,造成碱基插入,缺失,置换突变的因素客观存在,有不少降低发生的频率建议和措施,但是这些措施还停留在实验室阶段,还没有能够应用到规模化生产中。
  • 15.长链引物为什么出错的几率非常高?

    引物合成时,每一步反应效率都不能达到100%,产生碱基插入,缺失,置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长,突变的频率加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失,这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增,不可能绝对保证扩增产物中没有突变,引物合成也不可能保证100%正确。要知道,引物合成中发生错误(非人为因素)的频率,比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成,长链引物合成,您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。
  • 16.引物是经过PAGE纯化的,为什么还有碱基缺失或插入?

    理论上分析型PAGE变性电泳,可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳,上样量都是非常大,电泳时的条带非常宽,带与带之间有重叠,分辨率已下降,电泳后割带回收目的引物时,很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象,PAGE纯化的引物,特别是长引物要的量都比较高,导致割的条带有时可能比较宽。建议:您如果减少OD数,引物遇到的问题可能就会少一些。
  • 17.为什么OPC或PAGE纯化的引物,再用HPLC鉴定纯度不高?

    有些用户引物需要纯度特别高的引物,在使用前会将HPLC鉴定引物的纯度,常常发现引物的纯度一般在70%左右。问题来了,还有那30%是什么? 引物纯化PAGE,需要电泳,用缓冲液将引物浸泡出来,然后用C18浓缩,乙醇沉淀。沉淀得到的核酸物质基本引物了,除此以外,还有其他一些非核酸类物质,他们一般不会干扰引物的使用。OPC纯化也类似的情况。即使是HPLC纯化的引物,如果对成品进行分析,一般也难达到很高的纯度,引物您得到的纯品都是由制备柱过来,洗脱峰经过浓缩抽干,部分非核酸物质被富集。
  • 18.为什么修饰引物的产量要比一般引物低,价格要高?

    主要因为是修饰单体稳定性较差,偶连时间长,效率低,最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化,纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍,所以产品的价格自然高。
  • 19.引物不纯会有什么后果?

    引物不纯可能会导致:1)非特异性扩增;2)无法用预先设计在引物5"端酶切位点的酶切开,特别是没有保护碱基的引物;3)用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。
  • 20.为什么我们的引物重合了几遍都扩增不出来?

    有些PCR扩增没有成功,怀疑是引物不好。要求我们重合,没有问题。可是有时遇到重合数次的引物PCR扩增还是不成功。这种情况的出现一般都是用户自己的原因。对于引物合成,我们只能做到合成的引物没有问题,至于您是否能够扩增出来您需要的产物,那得靠您自己对实验本身的理解和把握。我们不能杜绝我们不犯错误,但是引物合成犯同样错误的几率很小,想犯同样的错误都难。 PCR扩增不成功的因素很多,需要您耐心地分析,最好在实验时设置对照来判定原因。 如果您怀疑引物的问题,请您首先测定您溶解的引物的OD值,看实验时加入的引物量是否正确。如果量是正常的,请您告诉我司您的引物编号,我们会复查留存样品。如不明原因,我们免费为您重新合成一次。如果仍然不能扩增,请您查找其它原因。