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科研服务

引物合成

常见问题

  • 1. 如何测定引物的OD值?                                    

    用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量,请注意紫外分光光度计的使用,测定时溶液的吸光度稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度,即为所测体积的OD值,进而可以计算出母液的OD值。 举例:您拿到一管干粉的DNA,用1ml水溶解成母液,取该母液50μL稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的吸光度为0.25,说明该50μL中含有0.25OD的DNA,也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。                                    

  • 2. 如何检测引物的纯度?

    实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,<12个碱基的引物用20%的胶,12-60个碱基的引物用16%的胶,>60个碱基的引物用12%的胶,取0.2OD左右的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95oC,2min)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的(有时由于变性不充分,主带之上可能会有条带,乃是引物二级结构条带)。
  •    3. 合成引物的稀释与保存?                                    

    初始拿到的DNA,其性状为薄膜状或者粉末状的白色粉末,附在离心管内壁上。稀释前,请将引物管离心数秒使DNA聚集到管低,小心开启管盖,以免引起粉末飞扬造成DNA损失,再加入适量的TE缓冲液,盖好管盖,漩涡振荡混匀并使其充分溶解。建议将引物稀释于TE(10mM Tris-HCL,pH8.0,1mM EDTA)溶液中,浓度高于10μM,并于-200C储存。 例如:如果您需要稀释到10μM,只需要加入(管内总nmol数/10)ml的TE即可。没有溶解的引物非常稳定,可以在-20℃下保存至少1年,溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液,分装数份保存于-20℃冰箱,可以保存至少半年以上(反复多次冻融会降低使用寿命)。                                    

  • 4. 荧光标记的DNA如何稀释与保存?                                    

    荧光标记(如HEX,TET,FAM,Cy3,Cy5等)的DNA对光较敏感,在合成及运输过程中。接到合成引物后,请立即避光保存。对于非Cy类的荧光标记引物,建议将引物稀释于TE溶液中,浓度高于10μM,并于-20℃储存于暗盒中。Cy3及Cy5标记的引物在碱性条件下易降解,所以此类引物应于中性条件下在-20℃避光保存。                                    

  • 5. 一般的合成的引物在5"和3"末端有磷酸基团吗?

    没有,5"和3"末端均为-OH基。如需要加磷酸基团,订货时请特别注明,此时需收取磷酸化的费用。
  • 6. 如何将两条互补的单链退火形成双链?

    用退火缓冲液(10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA)溶解引物, 将要退火的引物等摩尔数混合,总体积不要超过500微升,加热到95℃ 2mins,然后缓慢冷却至室温(低于30度)即可。退火的产物可以放在4度待用。
  • 7. 引物在常温下运输,会降解吗?

    不会降解,干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上。而一般的运输时间通常都在1-3天,所以您收到的引物不会降解。
  • 8. 合成的引物进行PCR反应时无目的带,怎么办?

    PCR反应失败的原因很多,可以从以下几个方面考虑。 1) 引物和模板是否配对,同源性有多大? 2) 引物本身是否有立体结构? 3) PCR反应用试剂是否能正常工作? 4) PCR仪是否工作正常? 5) PCR反应条件是否合适? 如果一切正常,还无法解决问题时,我们可以免费重新合成引物。
  • 9. 已经溶解的引物,为什么原先使用正常,而过一段时间再使用就不好了?                                    

    如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶,会使引物降解。使用时没有充分解冻混合,液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物,避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5),引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题,而是PCR使用材料是模板的质量与先前使用的不完全一致。                                    

  • 10. 引物纯化方式有哪些,如何选择?                                    

    ◆ C18柱脱盐:有人称其为简易反相柱,它对DNA有特异性的吸附,可以被有机溶解洗脱,但不会被水洗脱,所以能去除盐分。它不能去除比目的片段短的小片段。实际上,它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。 ◆ PAGE纯:PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于95%,对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化。 ◆ HPLC纯化:HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高,批量生产效率不高。                                    

  • 11. 如何计算引物的Tm值?

    引物设计软件都可以给出Tm,引物长度,碱基组成,引物使用缓冲的离子强度有关。 长度为25mer以下的引物,Tm计算公式为:Tm = 4℃(G C) 2℃(A T) 对于更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为: Tm = 81.5 16.6 x Log10[Na ] 0.41 (%GC) – 600/size 公式中,Size =引物长度。
  • 12. 引物(含修饰)的分子量是如何确定的?

    非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5,引物的分子量=碱基数 x碱基的平均分子量。或按下列公式计算MW= (NA * WA) (NC * WC) (NG * WG) (NT * WT) (Nmod * Wmod)+(Nx * Wx) ( Ni* Wi) 16* Ns– 62.NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量,WA, WC, WG, W, Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量,Nmod,Wmod, 分别为修饰基团的数目和分子量。 对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数,例如G A混合的分子量为(313.21 329.21)/2 = 321.21。Ns为硫代数目,硫代每个位置增加分子量16。 常规碱基分子量
  • 13.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题?                                    

    连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上,引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上,需要检查载体的酶切效果,SiRNA分子具有特殊的对称结构,退火的难度较大,退火时需要提高退火温度。