1. 如何测定引物的OD值？
用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的吸光度稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。 举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取该母液50μL稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。
3. 合成引物的稀释与保存?
初始拿到的DNA，其性状为薄膜状或者粉末状的白色粉末，附在离心管内壁上。稀释前，请将引物管离心数秒使DNA聚集到管低，小心开启管盖，以免引起粉末飞扬造成DNA损失，再加入适量的TE缓冲液，盖好管盖，漩涡振荡混匀并使其充分溶解。建议将引物稀释于TE（10mM Tris-HCL，pH8.0，1mM EDTA）溶液中，浓度高于10μM，并于-200C储存。 例如：如果您需要稀释到10μM，只需要加入（管内总nmol数/10）ml的TE即可。没有溶解的引物非常稳定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液，分装数份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反复多次冻融会降低使用寿命）。
4. 荧光标记的DNA如何稀释与保存？
荧光标记（如HEX,TET,FAM,Cy3，Cy5等）的DNA对光较敏感，在合成及运输过程中。接到合成引物后，请立即避光保存。对于非Cy类的荧光标记引物，建议将引物稀释于TE溶液中，浓度高于10μM，并于-20℃储存于暗盒中。Cy3及Cy5标记的引物在碱性条件下易降解，所以此类引物应于中性条件下在-20℃避光保存。
9. 已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？
如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料是模板的质量与先前使用的不完全一致。
10. 引物纯化方式有哪些，如何选择？
◆ C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能去除盐分。它不能去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。 ◆ PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化。 ◆ HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。
13.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？
连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。
